삶의 질은 미용 피부 문제로 인해 부정적인 영향을 받을 수 있으며, 일반적인 치료법 중 하나는 피부 톤을 밝게 하거나 어떤 경우에는 피부의 멜라닌 수치를 낮춰 피부 안색을 밝게 하는 합성 또는 천연 물질을 사용하여 밝게 하는 것입니다. 따라서 피부 미백은 주근깨, 변색된 피부 또는 여드름으로 인한 흉터 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 피부 미백 제품은 일반적으로 완벽하게 빛나는 피부를 약속하며 오랫동안 여성에게 인기가 있었고 오늘날에는 남성에게도 인기가 있습니다 .1 , 2 , 3. 아시아에서는 피부를 희게 하는 제품에 대한 수요가 상당합니다. 아시아인의 피부는 자연스럽게 수분이 더 많기 때문에 과색소 침착 또는 저색소 침착 문제가 더 자주 관찰됩니다. 아시아인은 나이가 들면서 주름이 덜 생기지만 피부 톤이 고르지 않을 가능성이 더 큽니다. 게다가 많은 아시아인이 더 서구적으로 보이기를 원하므로 피부를 희게 하려고 노력하십시오 .2 . 포유류에서 멜라닌은 우세한 피부 색소이며 티로신이 효소 산화를 겪을 때 멜라닌 세포에서 형성됩니다. 멜라닌은 피부에 해로운 자외선(UV) 조사, DNA 손상 및 산화 스트레스로부터 보호합니다. 자외선 조사로부터 보호하는 것은 피부암을 예방하는 데에도 도움이 됩니다. 그러나 멜라닌은 얼룩덜룩하거나 햇볕에 탄 피부를 유발하는 부정적인 영향도 있으므로 멜라닌 합성을 차단할 수 있는 물질은 피부를 하얗게 하는 화장품으로 효과적일 가능성이 높습니다. 멜라닌 합성은 멜라노좀에서 일어난 후 근처의 표피 각질 세포로 이동합니다. 티로시나아제(TYR), TYR 관련 단백질 1(TRP-1), TYR 관련 단백질 2(TRP-2)와 같은 멜라닌 세포 특이 효소가 다수 존재하여 멜라닌 생성 과정을 조절합니다 4 , 5 , 6 .

이핵 구리 효소인 TYR의 한 가지 역할은 멜라닌 생성을 조절하는 것입니다. 티로신의 수산화와 3, 4-디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA)의 o-도파퀴논으로의 산화를 위한 촉매 역할을 하는데, 이는 멜라닌 합성 중에 발생하는 속도 제한 반응입니다. 피부색은 멜라닌 합성 수준과 멜라닌의 종류, 각질 세포를 통해 분포되는 방식에 따라 달라집니다. 최소한의 부작용으로 TYR을 효과적으로 억제하는 것은 피부과 및 미용 과학 분야에서 오랫동안 과제로 남아 있었습니다. 아황산염이나 코지산과 같은 다양한 강력한 TYR 억제제가 있음에도 불구하고 그 활용은 제한적입니다. 그러나 이러한 물질은 세포에 대한 독성이 강하고 물이나 산소가 있을 때 불안정하기 때문에 활용되지 않습니다 .7 , 8 , 9 식품 또는 화장품 분야에서 사용되는 억제제는 가장 높은 안전 기준을 충족하는 것이 중요하므로 다양한 합성 및 천연 TYR 억제제가 알려져 있지만 세포 독성, 낮은 용해도 또는 피부 흡수 측면에서 적합하지 않기 때문에 피부 미백제로 사용하기에 대체로 적합하지 않습니다. 피부 미백 제품에 적용된 TYR 억제제 중 일부는 발암성이 있는 것으로 나타났습니다. WHO는 일부 피부 미백제가 암을 유발할 수 있다고 조언했으며 유해한 독소인 수은이 때때로 멜라닌 생성을 억제하기 위해 피부 미백 제품에 사용된다고 언급했습니다 10 , 11 . 이러한 맥락에서 천연 또는 유기농 제품이 점점 더 인기를 얻을 가능성이 높으므로 연구자들은 비교적 안전하고 매우 효과적일 수 있는 천연 펩타이드에 초점을 맞추려고 했습니다. 따라서 합성 펩타이드에서 파생된 TYR 억제제 펩타이드와 단백질 및 단백질 가수분해물을 조사하여 메커니즘과 효능을 확인하기 위한 다양한 연구가 수행되었습니다. 천연 화합물은 바람직하지 않은 부작용이 없는 것으로 인식되기 때문에 가장 큰 주목을 받았습니다. 또한, 단백질 모방 및 높은 생체 적합성을 가진 펩타이드의 이점을 제공하므로 화장품 및 제약 분야의 새롭게 개발된 제품에서 활성 성분으로 사용할 수 있는 잠재력이 있습니다 12 , 13 . 따라서 TYR 활동은 우유 14 , 갈라진 아가미 버섯 15 , 꿀 16 , 실크 17 , 깃털 18 , 얼룩 바빌론 19 , 해파리 20 를 포함한 일반적인 출처의 펩타이드와 단백질에 의해 억제될 수 있는 것으로 보입니다 .

꿀벌 꽃가루는 벌집에서 꿀, 꿀벌의 타액, 꽃가루 알갱이로부터 생산됩니다. 양봉가가 벌집에서 안전하게 수확할 ​​수 있습니다. 영양이 풍부하여 지질, 탄수화물, 단백질, 식이 섬유와 함께 미네랄, 비타민, 페놀 및 휘발성 화합물을 제공합니다. 다양한 식물 종의 꽃가루에서 약 200가지의 다른 물질이 발견되었지만 꿀벌 꽃가루는 생물학적으로 활성한 성분으로 인해 여전히 주목할 만합니다. 영양학적 관점에서 볼 때 기능성 식품으로 분류될 수 있으며, 이는 의료 및 식품 산업 모두에서 그 잠재력을 조사하기 위한 연구를 초대했습니다 21 , 22 . 최근 몇 년 동안 연구에서 효소 가수분해 과정을 통해 꿀벌 꽃가루의 성능을 개선할 가능성을 조사했습니다. 꿀벌 꽃가루 단백질 가수분해물(BPPH)은 Saisavoey 등이 보고한 바와 같이 가수분해되어 천연 생물학적 활성 펩타이드를 생성할 수 있습니다 23 . 꿀벌 꽃가루에서 추출한 효소 가수분해물이 NO 소거에 효과적인 반면, 중성효소 가수분해물은 항염증 특성을 갖는 펩타이드를 생성할 수 있음을 보여준 연구도 있습니다. NO 생성은 가장 작은 펩타이드 분획(< 0.65 kDa)에 의해 억제되는데, 이는 RAW264.7 대식세포에서 LPS로 유도된 IL-6, COX-2, iNOS, TNF-α 전사체의 발현을 상쇄할 수도 있어 효소 가수분해가 더 나은 항염증 활성으로 이어질 수 있음을 확인시켜 줍니다. Saisavoey et al. 24 는 알칼라제로 처리한 꿀벌 꽃가루가 항산화제 역할을 할 수 있고, BPPH에 의해 폐암 세포(ChaGo-K1)에 대해 항증식 활성이 나타나 세포 사멸을 촉진한다고 보고했습니다. 그러나 BPPH에서 TIP(티로시나아제 억제 펩타이드)가 생성된다는 보고는 널리 알려지지 않았습니다. 이러한 생물학적 활동은 효소 가수분해를 통해 생성될 수 있는 생물학적 활성 펩타이드의 더 다양한 종류와 전체 수에서 비롯된다고 주장됩니다. 인간 영양에서 생물학적 활성 펩타이드의 역할은 광범위한 관심을 끌었지만, 이 연구는 효소 가수분해에서 파생된 꿀벌 꽃가루 생물학적 활성 펩타이드에 초점을 맞추고 멜라닌 생성을 억제하는 능력을 조사합니다. 우리는 꿀벌 꽃가루가 멜라닌 생성 신호 전달 과정을 방해하여 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 TYR의 발현을 억제할 수 있는 TIP의 잠재적인 공급원이 될 수 있다는 견해를 취했습니다. 또한, 펩타이드가 멜라닌 생성을 억제하는 능력에 대한 생체 내 테스트가 제브라피쉬 배아에서 수행되었습니다. 따라서 꿀벌 꽃가루는 화장품 분야에서 중요한 성분으로 유용하게 응용될 수 있는 귀중한 생물학적 활성 펩타이드의 공급원이 될 수 있다는 결론을 내릴 수 있습니다.

다양한 프로테아제로 처리한 꿀벌 꽃가루 펩타이드의 농축

TIP는 현재 공정 제어가 쉽고 극단적인 반응 조건이 없기 때문에 효소 가수분해를 통해 널리 제조됩니다. TIP 생산을 지원하는 데 사용할 수 있는 상업적으로 생산된 효소에는 트립신, 키모트립신, 플레이버자임, 알칼리성 프로테아제, 중성 프로테아제, 파파인 등이 많이 있습니다. 기질과 효소 간의 결합 특이성이 다르기 때문에 주어진 물질에 대한 가수분해 영향이 효소마다 다를 수 있다는 것이 알려져 있습니다. 그러나 효소의 효소 분해 효과의 경우 동일한 효소라도 물질마다 다른 결과를 나타냅니다 . 12 이 연구에서 조사한 효소에는 중성효소, 알칼라제, 플레이버자임, 파파인, 펩신-판크레신이 포함되었습니다. 꿀벌 꽃가루 분말의 가수분해는 세 가지 특정 농도에서 다양한 프로테아제로 수행한 다음, 꿀벌 꽃가루 가수분해물의 TYR 억제를 고려하기 위해 비교를 수행했으며, 그 결과는 표  1 에 나와 있습니다 . 영어: 모노페놀라제 활성(50.01 ± 1.15 µg/mL)과 디페놀라제 활성(39.93 ± 0.60 µg/mL)에 대한 가장 낮은 IC 50  값은 5% (w/v) 중성효소를 사용하여 제조된 단백질 가수분해물의 경우 기록되었습니다. 가수분해물은 여러 펩타이드로 구성되어 있으므로 단일 분자이자 매우 강력한 표준 TYR 억제제인 ​​코지산과 다릅니다. 이러한 이유로 활성 화합물의 실제 농도는 IC 50  값에 대해 명시된 농도만큼 높지 않습니다. 따라서 이 연구는 가장 큰 효소 저해를 제공하는 가수분해물에 중점을 둡니다 .7 . 유사한 예가 Zhao 등의 연구에서 발견될 수 있습니다 .25 . 중성효소(1mg/mL)로 "풍단" 모란( Paeonia ostii ) 종자 밀가루 단백질을 가수분해한 결과 가수분해물이 TYR을 59.7% 저해하는 것으로 나타났습니다. 효소 가수분해 과정을 수행하기 전에 적절한 프로테아제와 원료를 선택하는 것이 필수적입니다. 단백질의 아미노산 구성이 다양하기 때문에 다양한 크기의 펩타이드가 방출되고, 각 펩타이드는 다양한 수준의 생물학적 활성을 제공합니다.

강력한 TYR 저해를 제공하는 이러한 단백질은 일반적으로 Trp, Phe, Gly, Val, Leu, Ile, Ala, Pro 및 Met와 같은 소수성 아미노산과 Tyr, Trp 및 Phe를 포함한 방향족 아미노산을 높은 수준으로 함유합니다. 중성 프로테아제의 한 유형으로 설명될 수 있는 Neutrase는 단백질을 가수분해하여  C 말단 에 Tyr, Trp 또는 Phe를 포함한 소수성 아미노산을 갖는 펩타이드를 생성하는 경향이 있습니다 26. 따라서 Neutrase는 고활성 TIP를 제조하는 데 적합한 프로테아제 역할을 할 수 있습니다. 수소 공여체 소수성 아미노산과 다양한 잔류물, 자유 라디칼 또는 금속 이온 사이에서 반응이 일어나는 반면, 방향족 아미노산은 공액 평면 고리를 가지고 있어 자외선을 흡수하는 동시에 TYR의 구리 이온과 π-π 상호 작용을 할 수 있습니다. TYR의 산화 활동은 Cu 2+ 와의 결합에 의해 방해받는 경향이 있으며 , 이는 멜라닌 합성을 제한합니다 12 . 요약하자면, TIP를 얻기 위한 현재의 접근 방식은 효소 종을 스크리닝한 다음 효소 분해 과정을 최적화하고 효과적인 정제를 하는 것을 포함합니다. 이 연구에서는 TYR 저해 수준이 가장 높은 접근 방식이기 때문에 순서대로 중성 효소를 사용했습니다. 그런 다음 이러한 결과를 사용하여 초여과(UF) 단계를 안내했습니다.

준비된 BPPH의 UF

단백질 분획과 펩타이드에서 효소 가수분해물을 얻은 후, 추가 실험을 수행하기 전에 이러한 펩타이드를 분리하기 위해 추가 여과를 수행해야 합니다. 펩타이드는 세포 배양에서 멜라닌 생성 억제 능력을 결정하거나 시험관 내 분석을 통해 항-TYR 특성을 평가하기 전에 다른 물질에서 정제 및 분리되어야 합니다. 이는 불순물이 이러한 분석 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 생물학적 활성 펩타이드에 대한 대부분의 연구는 분석을 시작하기 위해 막 분획 기술을 사용합니다. 정제 단계는 분자 크기에 따라 분획을 분리할 수 있는 막을 사용하여 단백질 가수분해물과 펩타이드를 여과하는 것으로 시작됩니다. 식품 부문에서는 일반적으로 분자 크기에 대해 하위 분획이 1~100kDa 범위에 속하는 UF가 필요합니다 . 그런 다음 다양한 하위 분획 의 활동 수준을 비교하여 생물학적 활성에 대한 초기 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 가장 유망한 단백질 가수분해물은 막으로 분리하여 일반적으로 분자량 > 10 kDa, 분자량 5–10 kDa, 분자량 3–5 kDa, 분자량 3–0.65, 분자량 < 0.65 kDa인 다양한 크기의 펩타이드를 형성할 수 있습니다.그런 다음 실험 절차를 설명하는 섹션에서 설명한 대로 모노페놀라제 및 디페놀라제 맥락에서 TYR 억제제 역할을 할 수 있는 용량을 확인하기 위해 시험관 내 TYR 억제에 대한 검정을 수행할 수 있습니다.표  2 에  결과를 제시합니다.  모노페놀라제 활성(1.08 ± 0.50 µg/mL)과 디페놀라제 활성(1.82 ± 0.80 µg/mL)에 대한 가장 낮은 IC50 값은 분자량 < 0.65 kDa에서 5% (w/v)의 중성효소로 제조된 단백질 가수분해물에 대해 얻어졌습니다.한편, Prakot et al . 19 점박이 바빌론 달팽이의 단백질 가수분해물에서 유래한 펩타이드에서 가장 높은 수준의 TYR 저해를 보고했는데, 이 경우 분자량이 3,000 Da 미만이었습니다. Deng et al. 28 . 은 유사한 결과를 보고했으며, UF 후 중국 모과 씨앗의 단백질 가수분해물의 분자량이 작은 분획에서 더 큰 TYR 저해가 나타났다고 언급했습니다. 이러한 추세에 따라 0–3 kDa 분획을 선택하여 추가 정제를 거쳤습니다. Pongkai et al. 18