1 서론

영어: 속씨식물의 수컷 배우체 세포로 구성된 화분은 식물의 수컷 세포를 캡슐화한 미세한 입자가 특징인 미세 분말 물질입니다(Campos et al.  2008 ). 수세기 동안 전통 의학과 기능성 식품의 영역에 포함된 꿀벌 화분은 항염, 항산화, 항균 및 면역 강화 속성을 포함한 다양한 치료적 특성을 가지고 있다고 여겨져 왔습니다(Denisow and Denisow-Pietrzyk  2016 ). 최근 수십 년 동안 양성 전립선 비대증과 만성 전립선염을 완화하는 데 탁월한 효과가 있어 꿀벌 화분에 대한 관심이 다시 급증했습니다(Algethami et al.  2022 ; Chabot et al.  2021 ; Qiao, Xiao, et al.  2023 ).

세계 인구가 고령화됨에 따라 남성의 만성 전립선염 발생률이 증가하고 있으며, 나이가 많은 것은 이 질환의 발병에 있어 중요한 위험 요소입니다.만성 비세균성 전립선염(CNP)은 임상적으로 만성 골반 통증이나 불편함과 함께 배뇨 증상 및 성 기능 장애를 유발하는 지속적인 염증 과정으로 정의됩니다(Zhang, Liang, et al.  2020 ).이것은 중요한 남성 건강 관리 문제로 떠올랐으며, 임상의와 연구자 모두의 상당한 관심을 끌고 있습니다(Krieger et al.  2003 ).특히, 북미, 유럽, 아시아에서 실시한 임상 연구에 따르면 만성 전립선염 유병률은 언제든지 성인 남성의 2~10%인 반면, 남성의 약 15%는 평생 전립선염 증상을 경험하는 것으로 나타났습니다(Krieger et al.  2003 ). 또한 이전 연구에서는 만성 전립선염과 양성 전립선 비대증 및 전립선암 발병 위험 증가 사이에 잠재적인 연관성이 있음을 나타냈습니다(Zhang, Wang, et al.  2020 ). 다행히도 연구자들은 꽃가루 또는 꽃가루 추출물이 만성 전립선염을 예방하고 치료하는 데 상당한 효능을 보인다는 것을 발견하여 전 세계적으로 널리 사용되고 있습니다(Algethami et al.  2022 ; Chabot et al.  2021 ; Lazzarotto-Figueiró et al.  2020 ; Martinez-Armenta et al.  2021 ; Münstedt and Bogdanov  2009 ; Nakase et al.  1990 ). 중국에서는 유채꽃가루로만 만든 풀레안 캡슐이 만성 전립선염과 전립선 비대증에 대한 우세한 약제 옵션으로 떠올랐습니다(Qiao, Xiao, et al.  2023 ). 임상 시험에서 풀레안 캡슐은 만성 전립선염 및 전립선 비대증 환자의 증상을 효과적으로 완화할 수 있으며 증상 완화율이 90%를 넘는 것으로 나타났습니다(Qiao, Xiao, et al.  2023 ). 더욱이, 유채꽃가루 추출물은 CNP와 관련된 증상을 상당히 완화하는 것으로 밝혀졌습니다(Wagner et al.  2013 ; Yang et al.  2014 ). 이 효과는 전립선 후엽 내의 미토푸신-1(Mfn1) 수치의 하향 조절과 DHT, 5α-환원효소, 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 수치의 억제를 포함한 몇몇 주요 분자적 요인을 조절하여 달성됩니다(Wagner et al.  2013 ; Yang et al.  2014 ). 유럽과 일본에서는 Cernitin(제약 브랜드, Cernilton), 흑맥초 꽃가루 추출물이 40년 이상 비세균성 전립선염 및 전립선 비대증을 치료하는 데 사용되어 왔으며 전체 성공률은 70%입니다(Chung et al.  2021) .; Thorpe 및 Neal  2003 ). 세르니틴은 만성 전립선염/만성 골반통 증후군과 관련된 전립선 특이 항원 수치를 현저히 감소시킬 수 있습니다. 전임상 연구에서 세르니틴은 유도 전립선염 쥐 모델에서 상당한 통증 완화 효과를 보였으며, 동시에 전립선 내 COX-2 및 MCP-1 수치가 현저히 감소했습니다(Chung et al.  2021 ; El-Khatib et al.  2019 ; Thorpe 및 Neal  2003 ). 세르니틴은 꽃가루 추출물의 두 가지 분획으로 구성되어 있습니다. 수용성 T60과 지용성 GBX(Chung et al.  2021 ; El-Khatib et al.  2019 ; Thorpe 및 Neal  2003 ). 두 분획은 동물 모델에서 염증을 뚜렷하게 감소시키고, 세포 증식을 억제하고, 평활근을 이완시킬 수 있습니다(Nakase et al.  1990 ). 증거에 따르면 T60 분획의 항-CNP 효과는 페룰로일 푸트레신(Nakase et al.  1990 )에 기인하는 것으로 나타났습니다.

페룰로일 푸트레신은 페룰산과 푸트레신이 아미드 결합을 통해 형성되는데, 이는 페놀아미드의 일종입니다. 페놀아미드는 히드록시신남산 아미드라고도 하며, 히드록시신남산(예: p-쿠마르산, 페룰산, 카페산)과 푸트레신, 스페르민, 스페르미딘과 같은 지방족 또는 방향족 아민이 결합하여 생성됩니다. 저희의 이전 연구에서는 꿀벌 꽃가루가 페놀아미드의 보고임을 밝혔습니다(Qiao, Feng 외,  2023 ). 20종의 단화(單花) 꿀벌 꽃가루에서 64종의 페놀아미드가 확인되었으며, 이는 알려진 천연물 중 가장 높은 함량을 보였습니다(Qiao, Feng 외,  2023 ). 더욱이, 지난 5년 동안 여러 연구에서 꿀벌 꽃가루에 풍부한 페놀아마이드가 존재한다는 사실이 보고되었습니다(Kim et al.  2018 ; Zhang, Zhu et al.  2023 ; Zhang, Wu et al.  2023 ). 따라서 꿀벌 꽃가루 또는 추출물의 전립선염에 대한 강력한 억제 기능은 풍부한 페놀아마이드에 기인할 수 있습니다. 그러나 페룰로일 푸트레신을 제외한 꿀벌 꽃가루의 다른 페놀아마이드들의 항-CNP 활성은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다.

본 연구는 꿀벌 화분에 함유된 페놀아마이드류의 항CNP 효과와 기전을 평가하는 것을 목표로 하였다. 먼저, LPS로 유도된 전립선 상피세포(RWPE-1) 모델을 이용하여 꿀벌 화분에 함유된 대표적인 6종의 페놀아마이드류의 항전립선염 활성을 스크리닝하였다. 이어서, CNP 랫드 모델을 이용하여 항전립선염 기전을 규명하였다.

2 재료 및 방법

2.1 재료

N(E), N'(E)-디 -p- 쿠마로일 푸트레신, N1(E), N10(E)-디 -p- 쿠마로일 스페르미딘, N1(E), N5(E), N10(E)-트리 -p- 쿠마로 )일 스페르미딘, N1(E), N5(E), N1rouma-p140(E  -p -coumaroyl-N14(E)-페룰로일 스페르민은 이전 연구(Qiao, Feng, et al.  2023 )에 따라 제조되었습니다(순도 ≥ 95%). N(E)-페룰로일 푸트레신(순도 ≥ 95%)은 Shanghai Yuanye Biotechnology Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. 모든 화학 구조는 그림  1A 에 나와 있습니다 .

인간 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 랫드 TNF-α, IL-1β, IL-6 키트는 Solarbio(중국 베이징)에서 구입했습니다. NO 키트는 Beyotime(중국 난징)에서 구입했습니다. 항-TNF-α 토끼 pAb(Servicebio, GB11188), 항-IL-1β 토끼 pAb(Servicebio, GB11113), 항-vIL-6 토끼 pAb(Servicebio, GB11117), Cy3 접합 염소 항-토끼 IgG(H + L)(Servicebio, GB21303). Beclin-1 pAb(YT5763), LC3 A/B 토끼 pAb(YT7936), GAPDH mAb(YM3029)는 ImmunoWay Biotechnology Company(미국 텍사스주 75024)에서 구입했습니다. 토끼 항-p62 항체(5114), p-AMPK(2535), AMPK(5831), p-mTOR(5536), mTOR(2983)는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입했습니다. 완전 프로인트 보조제(CFA)는 Sinopharm Co. Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. Cole's Hematoxylin 용액, Eosin Y 용액, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) pH 8.0은 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입했습니다. 기타 모든 실험 재료 및 소모품은 Solarbio Life Sciences(Beijing, China)에서 구입했습니다.

2.2 RWPE-1 세포 배양

불멸화 인간 전립선 상피세포주(RWPE-1)는 BNCC(중국 허난성)에서 구입했습니다. RWPE-1 세포는 케라티노사이트 성장 보충제(KGS, 카탈로그 번호 2152) 5 mL와 페니실린/스트렙토마이신 용액(P/S, 카탈로그 번호 0503) 5 mL를 첨가한 케라티노사이트 배지(ScienceCell, 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에서 5% CO2가 포함된 37°C 가습 배양기에서 배양했습니다 . CNP 모델은 10 μg/mL의 리포폴리사카라이드(LPS)를 첨가하여 24시간 동안 유도했습니다.

2.3 세포 생존율 검정

RWPE-1 세포 생존율은 메틸티아졸릴테트라졸륨 분석법(MTT, Solarbio, Beijing, China)을 사용하여 평가하였다. RWPE-1 세포(20,000개/웰)를 96웰 플레이트에 분주하고 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 대조군으로 0.1% DMSO가 포함된 신선한 각질세포 배지 1mL와 다양한 농도의 페놀아마이드(0, 1, 5, 10, 20, 40, 80 μmol/L) 1mL를 처리군으로 각각 교체하였다. 처리 후, 각 웰에 MTT 용액(5 mg/mL)을 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 리더(Biotek, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다. 세포 생존율은 다음 공식을 사용하여 백분율로 계산했습니다. 세포 생존율 = [(각 처리군의 평균 흡광도) / (대조군의 평균 흡광도)] × 100%.

2.4 RWPE-1 세포의 염증성 사이토카인 및 NO 생성

RWPE-1 세포를 24-웰 배양 플레이트에서 배양하고 다양한 농도의 페놀아미드(0, 1, 5, 10, 20, 40, 80 μmol/L)를 2시간 동안 처리한 후, 5 μg/mL LPS로 자극하고 24시간 동안 배양했습니다. TNF-α, IL-1β, IL-6 농도는 Solarbio(Beijing, China)의 시판 ELISA 키트를 사용하여 정량했습니다. Greiss 반응을 기반으로, NO 키트(Beyotime, Nanjing, China)를 사용하여 세포 배양 배지 내 일산화질소(NO) 농도를 측정했습니다.

2.5 동물 모델

모든 동물 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침을 따랐습니다.52개월 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐(190–220 g)는 중국 베이징의 특정 병원균 무함유(SPF) 생명공학 주식회사(면허: 110324231104817715; 동물 사용 허가: SYXK(JING) 2023-0004)에서 구입했습니다.모든 동물을 23°C ± 2°C, 상대 습도 55% ± 5%의 SPF 환경 조건에서 키웠습니다.또한 쥐는 12시간의 암흑-빛 주기(빛 주기: 오전 7시~오후 7시) 동안 음식과 물을 자유롭게 섭취했으며 실험 전에 새로운 환경에 적응할 수 있도록 1주일이 주어졌습니다.중국 농업 과학 아카데미 산하 양봉 연구소의 실험 동물 복지 위원회에서 윤리적 요구 사항을 승인했습니다. 난수표를 사용하여 36마리의 쥐를 무작위로 네 그룹( n  = 9마리/그룹)으로 나누었습니다. 이 그룹에는 대조군, 모델군, 그리고 N1(E), N10(E)-di- p -coumaroyl spermidine ( p -Csp) 저용량 또는 고용량군이 포함됩니다. 표본 크기는 이전 연구(Algethami et al. 2022 ; Chabot et al.  2021 ; Qiao, Xiao, et al.  2023 ) 를 기반으로 결정되었습니다  .

CNP의 쥐 모델은 이전에 설명된 방법인 CFA를 약간 수정하여 확립했습니다(Zhao et al.  2020 ). 대조군과 별도로, 개입에는 멸균된 CFA 현탁액(100 μL, 1% w/v)을 복측 전립선의 오른쪽과 왼쪽 엽에 주입하는 것이 포함되었습니다. 반면 가짜 수술을 한 쥐( n  = 9)에게는 같은 양의 멸균 식염수를 주입했습니다. 그런 다음 상처를 여러 겹으로 닫았습니다. 수술 과정 동안 이소플루란 흡입 마취를 사용했습니다. 이소플루란은 100% 산소에서 4%-5%의 유도 농도로 투여되었고 수술 중 1.5%-2.5%로 유지되었습니다. 마취 가스 혼합물은 동물이 의식을 잃고 통증이 없는 상태를 유지하도록 설치류에 특화된 코 콘을 통해 전달되었습니다. 대조군과 모델 그룹은 21일 동안 0.5% DMSO(w/w) 1 mL를 경구 투여했습니다. 나머지 두 그룹의 쥐에게는 체중  에 따라 5mg/kg(저용량 그룹, L- p -Csp) 및 10mg/kg(저용량 그룹 , H- p -Csp)의 농도로 0.5% DMSO(w/w)에 녹인 1mL p -Csp 를 21일 동안 경구 투여했습니다. 실험 마지막 날(22일)에 모든 쥐를 인도적으로 안락사시켰습니다. 동물(쥐)의 안락사는 동물의 안락사에 대한 AVMA 지침에 따라 이산화탄소(CO 2 ) 질식으로 수행했습니다. 고통을 최소화하기 위해 분당 챔버 부피의 30%~70%의 변위 속도로 CO 2를  챔버에 점차적으로 주입하여 호흡 정지 전에 의식을 잃게 했습니다. 그런 다음 전립선 조직을 조심스럽게 수확하고 즉시 무게를 측정했습니다. 전립선 지수는 전립선 무게와 전체 체중의 비율로 계산했습니다.

각 군의 처리 및 측정 순서는 미리 정해지지 않았으며, 매번 무작위로 진행되었습니다. 또한, 케이지 위치는 동물이 실험 시설에 도착했을 때 이용 가능한 주소로 의도치 않게 지정되었습니다.

2.6 조직병리학 및 면역조직화학

전립선 검체는 조직병리학적 검사를 위해 4% 포름알데히드에 하룻밤 고정시켰다. 고정된 전립선 검체를 파라핀에 포매하고 Leica RM2255 마이크로톰(Leica Biosystems, Leica, Germany)을 사용하여 5 μm 마이크로톰으로 절편을 만들었다. 자일렌으로 파라핀을 제거하고 알코올로 탈수한 후, 절편을 헤마톡실린-에오신 염색하였다. 이후, Nikon 디지털 사이트 DS-Fi2 시스템(Nikon, Tokyo, Japan)이 장착된 Nikon Eclipse Ci-L 현미경을 사용하여 선상피, 구조 및 공간을 면밀히 관찰하였다. 정상 전립선의 조직형태계측학적 변수는 대조군의 분석을 바탕으로 결정하였다.

5 μm 두께의 쥐 전립선 절편이 담긴 슬라이드를 인산 완충 식염수(PBS)로 꼼꼼하게 세척한 다음 0.1% Triton X-100이 포함된 PBS로 10분간 투과 처리한 다음 2% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS로 30분간 블로킹했습니다. 1차 항체를 적용하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 완전히 세척하고 2차 항체와 함께 실온에서 50분 동안 배양했습니다. 다시 한 번 꼼꼼하게 세척한 후 80i Nikon 현미경을 사용하여 면역 형광 이미지를 캡처했습니다. 이미지를 캡처하고 Aipathwell 소프트웨어(Servicebio, Wuhan, China)로 분석했습니다. 양성 세포 비율을 계산하여 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 발현을 분석했습니다. 양성 세포 비율 = 양성 세포 수/총 세포 수. 또한, 염증성 사이토카인을 스캔하여 시각화하기 위해 DS-U3 이미징 시스템(니콘, 도쿄, 일본)을 갖춘 Nikon Eclipse Ti 공초점 레이저 주사 현미경을 사용했습니다.

2.7 염증성 사이토카인

이 연구에서 우리는 ELISA 키트를 사용하여 혈청과 전립선 조직 모두에서 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 수준을 결정했습니다.혈청 분석을 위해 각 샘플을 혈청 분리 튜브(BD Biosciences, Rockville, USA)에 꼼꼼히 수집하고 실온에서 2시간 동안 응고되도록 했습니다.응고 기간 후, 응고를 제거하고 혈청 샘플을 얻기 위해 약 1000 × g에서 20분 동안 원심분리했습니다.전립선 조직의 경우 적절한 샘플 준비를 보장하기 위해 엄격한 프로토콜을 사용했습니다.각 전립선 조직 검체를 얼음처럼 차가운 PBS(0.01 M, pH = 7.4)로 꼼꼼하게 헹궈 잔류 혈액을 완전히 제거했습니다.그런 다음 전립선 샘플의 무게를 측정하고 전기 균질기를 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS에서 균질화했습니다.균질물을 5000 × g에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었습니다. ELISA 절차는 표준화와 정확성을 보장하기 위해 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 각 ELISA 분석은 세 번 반복되었습니다. 데이터는 면밀히 분석되었으며, 통계적 유의성은  p  < 0.05에서 확립되었습니다.

2.8 정량 실시간 PCR

전립선 조직을 액체 질소에서 완전히 분쇄한 후, TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출했습니다. 추출된 RNA는 PrimeScript RT 시약 키트(Takara, Beijing, China)를 사용하여 역전사 반응을 수행했습니다. 실시간 PCR은 7500 시스템(Applied Biosystems Inc., Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 2단계 반응 과정을 거쳐 수행했습니다.

하우스키핑 유전자 Gapdh의 발현을 이용하여 발현 수준을 정상화했습니다. 프라이머는 Primer Premier 6.0 소프트웨어(Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 인트론을 측면에 배치하도록 설계되었습니다. 용융 곡선을 통해 프라이머의 특이성을 확인했습니다. DNA 시퀀싱과 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 산물을 분석했습니다.

2.9 웨스턴 블롯

간단히 설명하면, 전립선 조직을 RIPA 용해 완충액을 사용하여 용해시킨 후, BCA 키트를 사용하여 단백질을 정량화했습니다. 단백질 샘플을 로딩하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 분리한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮긴 후, 5% 탈지유-TBST로 20°C에서 2시간 동안 블로킹했습니다. 그 후, 블롯을 1차 항체(anti-TFEB 1:500, Beclin-1 1:5000, anti-p62/SQSTM1 1:2000, anti-LC3 1:2000, and anti-GAPDH 1:20000, p-AMPK 1:2000, AMPK 1:2000, p-mTOR 1:2000 and mTOR 1:2000)와 함께 배양했습니다. 세척 후 2차 항체와 함께 배양한 후, Quantity One 소프트웨어(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 화학 발광, X선 필름 압축, 현상, 고정 및 데이터 분석을 수행했습니다. 결과는 세 번의 독립적인 실험을 통해 얻은 것입니다.