양봉 저밀도 및 고밀도 개체군 3세대 성장을 위한 꿀벌( Apis mellifera ) 유전자형 선택 진드기 Varroa dest…
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저밀도 및 고밀도 개체군 3세대 성장을 위한 꿀벌( Apis mellifera ) 유전자형 선택 진드기 Varroa destructor
간단한 요약
꿀벌 군집 손실의 주요 원인 중 하나는 기생성 진드기인 Varroa destructor 로 , 주로 살진드기로 제어하는데, 살진드기는 내성으로 인해 효능을 잃고 꿀을 오염시킬 수 있습니다. 대안은 Varroa 에 내성이 있는 벌을 번식시키는 것인데, 이 연구에서는 진드기 낙하에 대한 양방향 선택을 통해 Varroa 개체군 성장이 낮거나(내성) 높은(감수성) 군집을 얻었습니다 (각각 LVG 및 HVG). 3세대 선택을 한 결과, HVG 군집에 비해 LVG에서 Varroa 개체군 성장이 크게 감소했습니다. 또한 LVG 군집에서 벌의 Varroa 감염률이 낮았고, Deformed Wing Virus(DWV) 감염 수준이 낮았습니다. Varroa 에 기생된 벌의 생존율은 HVG 벌에 비해 LVG 벌에서 더 높았는데, 이는 군집의 겨울 생존율이 HVG 군집보다 LVG 군집에서 더 높은 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. LVG를 위해 벌 집단을 선택하면 개별 벌과 벌 집단의 건강이 더 좋아져 바로 아 진드기 를 방제하기 위한 육종 수단으로서 효과적이라는 것이 입증되었습니다.
추상적인
꿀벌( Apis mellifera ) 개체수 감소는 기생성 진드기인 Varroa destructor 와 관련이 있으며 , 현재는 주로 살진드기 살충제를 사용하여 제어합니다. 대안은 Varroa 에 대한 내성을 키우기 위해 번식하는 것인데 , 이 연구에서는 진드기 낙하에 대한 양방향 선택을 통해 Varroa 개체수 증가가 낮거나(내성) 높은(감수성) 군체를 얻었습니다(각각 LVG 및 HVG). 3세대 선택을 통해 LVG에서 Varroa 개체수 증가가 HVG 군체보다 약 90% 낮았습니다. 또한 늦여름 Varroa 감염률은 LVG 군체에서 모두 유의하게 낮았습니다( p < 0.01). 이는 또한 낮은 변형 날개 바이러스(DWV) 감염 수준과 유의하게 관련이 있었습니다( p < 0.01). Varroa 에 기생한 벌 의 생존율은 LVG 벌이 HVG 벌에 비해 거의 50% 더 높았습니다( p < 0.01). 또한, 군집 겨울 생존율은 LVG 군집이 HVG 군집보다 유의하게 높았습니다( p < 0.05). 그러나 LVG 군집에서 관찰된 더 높은 군집 개체수는 HVG 군집의 개체수와 유의하게 다르지 않았습니다. 전반적으로 LVG를 위한 군집을 선택함으로써 개체와 군집 건강이 개선되었으며, 이는 꿀벌 군집에서 Varroa 개체수를 제어하는 육종 수단으로서의 효과를 입증합니다 .
1. 서론
진드기 Varroa destructor는 서부 꿀벌( Apis mellifera L.)의 가장 해로운 기생충으로 알려져 있으며 전 세계적으로, 주로 북반구에서 높은 군집 손실과 관련이 있습니다[ 1 ]. Varroa는 주로 꿀벌의 지방 조직과 혈림프를 먹고[ 2 , 3 ], 꿀벌의 체중, 면역 반응, 수명 및 꿀 생산을 감소시킵니다[ 4 , 5 , 6 , 7 ]. Varroa 의 해로운 영향의 주요 요인은 변형 날개 바이러스(DWV)를 포함한 바이러스를 포함하는 타액입니다. 또한 꿀벌의 DWV 수치를 증가시킬 수 있는 Varroa 독성 단백질도 포함되어 있습니다[ 1 ]. DWV는 진드기 내에서 복제될 수 있으며 기생충을 통해 꿀벌로 전파될 수 있습니다[ 8 ]. DWV 감염은 때때로 새끼 벌의 몸과 날개가 변형되는 현상을 유발하며 성충의 수명이 단축되는 것과 관련이 있습니다[ 9 , 10 , 11 , 12 ]. 따라서 Varroa 와 DWV는 모두 꿀벌 사망과 집단 손실과 관련이 있습니다. 게다가 캐나다와 같은 북부 기후의 겨울 조건은 Varroa 와 DWV의 영향을 더욱 증폭시킵니다[ 12 , 13 ].
대부분의 양봉가들은 합성 살진드기로 벌집 Varroa 감염을 통제하지만, 기생충이 이에 대한 내성을 키울 수 있어 그 효능이 떨어진다[ 14 ]. 따라서 Varroa 내성을 위한 육종과 같은 대체 통제 전략이 필요하다 [ 15 , 16 ]. Varroa 에 대한 내성과 관련된 한 가지 메커니즘은 손질 행동으로, 벌이 몸에서 진드기를 물어뜯어 떨어뜨리는 것이며, 이는 '진드기 물어뜯는' 유전자형과 같은 꿀벌 종을 선택하는 데 사용되어 왔다[ 17 , 18 ]. 또 다른 메커니즘은 위생 행동으로, 벌이 병에 걸렸거나 죽은 새끼뿐만 아니라 Varroa 에 감염된 새끼도 식별하여 세포에서 제거하는 것이며, Varroa 에 민감한 위생 유전자형 과 같은 꿀벌 종을 선택하는 데 사용되어 왔다 [ 19 , 20 ]. Varroa 저항성을 높이기 위한 세 번째 옵션은 낮은 진드기 감염 수준을 위한 벌 유전자형을 선택하는 것입니다. 이는 시간 경과에 따른 진드기 감염 수준(즉, 낮은 Varroa 개체군 성장)을 측정하기 위해 군집 내 진드기 감소로 결정할 수 있습니다. 여기에는 'Arbeitsgemeinschaft Toleranzzucht'(AGT), Primorski Russian 및 낮은 Varroa 성장(LVG) 유전자형이 포함됩니다[ 21 , 22 , 23 , 24 ].
LVG 벌을 생산하기 위한 선발 프로그램에서 De la Mora et al. [ 24 ]은 Varroa 개체군 성장률이 낮은 두 세대의 선발이 Varroa 개체군 성장률이 높은(HVG) 벌집에 비해 진드기 개체군 성장률, 성충 및 새끼벌의 진드기 감염률, 겨울 벌집 사망률, DWV 수준이 상당히 낮은 벌집을 만들어냈다는 것을 보여주었습니다 . 그러나 저자는 진드기로 기생했을 때 벌집 벌 개체군과 일벌의 생존율을 평가하지 않았습니다. 또한 그 연구에 참여한 벌은 기생을 보장하기 위해 Varroa를 접종하지 않았기 때문에 내성이 벌집에 Varroa가 적어 기생을 피했기 때문인지, 아니면 기생된 벌 내의 항바이러스 메커니즘 때문인지 판단할 수 없었습니다 . 현재 연구에서는 이전 연구[ 24 ] 의 변수 와 군집 개체군 및 Varroa 기생이 꿀벌 생존에 미치는 영향을 평가하는 LVG 및 HVG에 대한 3세대 선택의 결과를 보고합니다. 결과적으로 이 연구는 추가 세대의 선택과 결합된 LVG 선택의 효과에 대한 보다 포괄적인 관점을 제공합니다.
2. 재료 및 방법
2.1. LVG 및 HVG 유전자형에 대한 선택적 육종 절차
번식 프로그램은 캐나다 온타리오주 궬프에 있는 궬프 대학교의 꿀벌 연구 센터(HBRC)에서 수행되었습니다(북위 43.5448°, 서경 80.2482°).선택적 번식 절차는 이전 연구에 따라 수행되었습니다[ 24 , 25 ].간단히 말해, 군집의 진드기 개체수는 3일 동안 끈적끈적한 보드에 떨어진 Varroa 진드기 의 수를 세어서 결정한 다음 , 이를 3으로 나누어 하루 평균을 구했습니다.진드기 개체수 증가는 이른 봄(5월)에 떨어진 진드기의 수와 15주 후인 늦여름(8월)에 떨어진 진드기의 수를 비교하여 결정했습니다.Varroa 개체수 증가(LVG)가 가장 낮은 3개 군집 과 Varroa 개체수 증가( HVG ) 가 가장 높은 3개 군집 을 De la Mora 등에 따라 각 세대별로 선택했습니다[ 24 ]. 이러한 군집은 초가을에 아미트라즈 스트립(Apivar ® , Véto-Pharma, Palaiseau, France)으로 Varroa 에 대해 처리하여 겨울 동안 생존을 보장했습니다.다음 봄에 각 유전형에 대해 100마리 이상의 여왕을 키웠고, 선택된 군집에서 유충을 이식하여 각 세대를 만들었습니다.키운 여왕은 다른 양봉장에서 최소 5km 떨어진 공통 교미장에서 공개 교미를 하도록 두었고, 이 교미장은 Buckfast 균주의 수컷을 생산하는 군집으로 둘러싸여 있었습니다.각 세대를 만들기 위해 10개 양봉장에 걸쳐 최소 100개의 군집에서 여왕을 제거하고, 각각을 두 부분으로 균등하게 나누어 절반은 육종실에서 LVG 여왕을 받고, 다른 절반은 다른 육종실에서 HVG 여왕을 받았습니다.이 관행은 두 유전형 모두에 대해 유사한 시작 진드기 수준과 군집 개체군 및 양봉장 조건을 보장했습니다. 도입된 여왕벌에서 유래된 군체는 계절 내내 동일한 방식으로 관리되었으며, 이전에 설명한 바와 같이 Varroa 개체수 증가 여부를 테스트했습니다.
2.2. 성충벌과 새끼벌의 Varroa destructor 감염률
3세대의 유전자형당 무작위로 선택된 20개의 군집을 성충 벌과 새끼 벌의 Varroa 감염률에 대해 평가했는데, 이는 100마리의 벌당 부착된 진드기 수와 100개의 세포당 진드기에 감염된 새끼 벌의 수를 기준으로 했습니다. 이러한 평가는 여름이 끝날 무렵에 실시했습니다. 성충의 경우, 각 군집의 양육 둥지에서 약 300마리의 벌을 수집하여 70% 에탄올 100mL에 넣고 De Jong et al. [ 26 ]에 따라 처리하여 100마리의 벌당 진드기 수를 확인했습니다. 새끼의 경우, 분홍-보라색 눈이 있는 번데기가 들어 있는 약 200개의 일벌 새끼 벌의 뚜껑을 열고 100개의 세포당 진드기에 감염된 새끼 벌의 백분율을 계산했습니다 [ 27 ].
2.3. DWV 감염 수준
영어: 세 번째 세대 선택에서 각 유전형의 무작위로 선택된 3개 군집의 모란지에서 늦여름에 최소 15마리의 성충 꿀벌을 수집했습니다.꿀벌은 즉시 -80°C에서 동결시켰습니다.DWV의 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)은 Morfin et al. [ 28 ]에 따라 RNA 추출을 위해 수정하여 수행했습니다.간단히 말해, 각 샘플에서 15마리의 동결된 꿀벌을 제조업체의 지침에 따라 5mL의 One Step RNA Reagent(BioBasic, Markham, ON, Canada)로 침지했습니다.침지액을 새로운 1.5mL 원심분리관에 옮겨 20~22°C에서 5분간 배양했습니다.그런 다음 300µL의 클로로포름을 첨가하고 관을 15초 동안 7000rpm으로 진탕했습니다. 20~22 °C에서 2~3분간 배양한 후, 튜브를 원심분리(Symphony 417R, VWR, Mississauga, ON, Canada)하여 4 °C에서 15분간 12,000× g 로 분리했습니다.수성 상을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 99% 이소프로판올 500 µL를 첨가했습니다.튜브를 20~22 °C에서 10분간 배양한 다음, 4 °C에서 10분간 12,000× g 로 원심분리했습니다 .RNA 펠릿을 70% 에탄올 1 mL로 세척하고, 역위로 혼합한 후, 4 °C에서 5분간 7500× g 로 원심분리했습니다 .이 과정을 두 번 더 반복했습니다. 건조 후, RNA 펠릿을 30 µL의 Invitrogen UltraPure H 2 O(Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 용해시키고, NanoDrop Lite(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)를 사용하여 RNA 품질을 평가했습니다. RNA 샘플은 -80 °C에서 보관했습니다.
샘플당 2mg의 RNA와 Fermentas Revert Aid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada)을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 cDNA를 준비했습니다. cDNA는 QuantStudio3 열순환기(Real-Time PCR Systems, Fisher, Pittsburgh, PA, USA)로 증폭했습니다. DWV 유형 A의 전방 프라이머는 5' GCGCTTAGTGGAGGAAATGAA 3'이고, 역방 프라이머는 5' GCACCTACGCGATGTAAATCTG 3'입니다[ 29 ]. 각 qPCR 반응은 2 µL cDNA, 0.4 µL 정방향 및 역방향 프라이머(200 nM), 10 µL PowerUp TM Sybergreen(2×)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 7.2 µL 핵산 분해 효소가 없는 H 2 O를 포함하는 20 µL로 구성되었습니다. 음성 대조군은 cDNA 대신 핵산 분해 효소가 없는 H 2 O 2 µL였습니다 . 양성 대조군은 이전에 확인된 DWV 양성 꿀벌 cDNA 샘플이었습니다. PCR 조건은 48 °C에서 15분과 95 °C에서 10분 동안 1사이클을 수행한 다음 95 °C에서 15초와 60 °C에서 60초 동안 40사이클을 수행한 다음 68 °C에서 7분 동안 1사이클을 수행했습니다. Ct 값을 DWV 게놈 사본(gc)으로 변환하기 위한 교정 곡선은 전방 프라이머, 앰플리콘 및 역방향 프라이머의 시퀀스를 포함하는 300 bp gBlocks(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 동결 건조된 gBlocks는 dsH 2 O에 희석하여 10 9 에서 10 2 사본으로 10배 연속 희석했습니다 . Ct 값과 DWV 사본 수(log10)의 플롯을 사용하여 선형 방정식을 사용하여 DWV 게놈 사본 수를 계산했습니다[ 30 ]. 각 샘플에 대해 3번의 기술적 반복을 수행했습니다. 추정되는 DWV의 무작위로 선택된 앰플리콘은 University of Guelph Laboratory Services에서 시퀀싱하여 동일성을 확인했습니다.
2.4. 군집 개체수와 겨울 군집 사망률
진드기 수준을 평가하기 위해 샘플링한 유전형당 무작위로 선택된 20개의 군집은 늦여름에 성충 벌 개체군을 평가하는 데에도 사용되었습니다.간단히 말해, 각 프레임(0~1)에서 벌이 덮은 면적의 시각적 추정치를 얻은 다음 880을 곱했는데, 이는 깊은 Langstroth 프레임의 총 빗살 면적(cm 2 )에 해당합니다.그런 다음 결과에 cm 2 당 벌 수 (1.38)를 곱했습니다[ 31 ].월동한 두 유전형의 군집 생존률은 4월 말에 시각적으로 확인하여 살아 있거나 죽은 군집의 비율을 확인했습니다.
2.5. 진드기 기생에 대한 개별 벌의 생존
Varroa 의 암컷 진드기는 실험용 벌과 관련이 없는 심하게 감염된 군집에서 수집되었습니다. 이는 Dietemann et al. [ 27 ] 에 따라 CO 2 로 마취된 성충 벌에서 기생충을 분리하여 수행되었습니다. 수집된 진드기는 필요할 때까지 젖은 종이 타월이 깔린 플라스틱 페트리 접시에 미세한 페인트 브러시로 놓아두었습니다.
일벌로 덮인 두 개의 틀을 유전형당 3세대 군집의 중앙에서 회수한 다음 5L 용기에 흔들어 간호벌을 수집했습니다.각 군집에서 10마리의 벌을 5개의 나무 Benton 케이지(75×25×16mm)에 넣어 처리당 총 50마리의 벌을 넣었습니다.각 케이지의 벌은 4가지 처리 중 하나를 거쳤습니다: (1) Varroa가 없는 LVG 벌 ; (2) Varroa가 있는 LVG 벌 ; (3) Varroa 가 없는 HVG 벌 ; (4) Varroa 가 있는 HVG 벌 .실험은 반복마다 다른 출처 군집을 사용하여 세 번 반복했습니다.Varroa 노출의 경우 , 벌에게 미세한 페인트브러시가 있는 진드기를 각 벌 위에 놓아서 개체당 하나의 진드기로 인공적으로 기생시켰고, 케이지는 8일 동안 32~35°C와 60% RH에서 유지되었습니다[ 7 ]. 꿀벌은 여왕 사탕(가루 설탕과 섞은 포도당)을 먹었고, 케이지 스크린에 dsH 2 O가 든 깨끗한 스펀지를 놓아 하루에 두 번 물을 주었습니다. 꿀벌 사망률을 기록했고, 죽은 꿀벌은 매일 케이지에서 꺼냈습니다.
2.6. 통계 분석
데이터는 Shapiro–Wilk 검정을 통해 정규성을 분석했습니다. 정규 분포가 아닐 경우 데이터를 변환했습니다. Varroa 개체군 변화율 및 DWV 사본에 대한 데이터는 로그 변환되었고, 성??
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