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양봉 토종 꿀벌 비텔로게닌의 Cryo-EM 구조

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작성자 관리자
댓글 0건 조회 4회 작성일 25-07-04 10:42

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토종 꿀벌 비텔로게닌의 Cryo-EM 구조

다중 발현(pleiotropy) 또는 단일 유전자가 여러 표현형 특성에 영향을 미치는 능력은 일반적인 현상이지만 일반적으로 분자 수준에서는 잘 이해되지 않습니다. 다중 발현의 흥미로운 예는 대형 지질 전달 단백질(LLTP) 슈퍼패밀리에서 발견됩니다. LLTP는 주로 동물의 지질 순환 수송을 담당하며, 다세포성과 관련된 지질 수송의 증가된 필요성과 관련이 있습니다 1 . 슈퍼패밀리의 구성원에는 포유류 아폴리포단백질 B(apoB), 미세소체 트리글리세리드 전달 단백질(MTP), 비텔로제닌(Vg) 및 곤충 아폴리포포린 II/I(apoLp-II/I)가 있습니다. 흥미롭게도 일부 LLTP는 진화 역사를 따라 새로운 기능을 획득했습니다. 체액에서 비교적 고농도로 순환한다는 점을 고려하면 이러한 새로운 기능은 종종 면역과 관련이 있습니다. 여기에는 항원 제시 2 , 혈액 응고(Hoeger 및 Harris3의 2장에서 검토 ) 및 apoLp-II/I의 다른 많은 기능(Hoeger 및 Harris3의 4장과 5장에서 검토 ) 에 대한 관여가 포함됩니다 . 특히, 다형성은 난황 전구체인 지질-당-금속-인산단백질 Vg에 대해 가장 발달된 것으로 보입니다.

Vg는 거의 모든 난포 형성 동물에 존재하며 전통적으로 난황 형성 맥락에서 암컷 특이적 단백질로 연구되었습니다 4. 난황 형성 동안 체세포 계통에 의한 Vg 합성이 촉진되고 단백질은 순환계로 방출되고, 거기서 난황 단백질의 주요 전구체로서 난모세포에 의해 내재화됩니다. 따라서 Vg는 발달 중인 난에 아미노산, 이온, 지질 및 지용성 비타민과 호르몬을 제공합니다. 지난 20년 동안 Vg의 면역 기능에 대한 데이터는 산호 5 , 연체동물 6 , 7 , 절지동물 8 , 9 , 10 , 어류 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 과 같이 다양한 분류군에서 나타났습니다. Vg는 항균 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 17 , 18 및 항바이러스 16 활동을 하는 것으로 밝혀졌습니다 . Vg는 다양한 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 6 , 18 을 인식하여 병원체를 직접 사멸시킴으로써 이러한 활동을 수행합니다. 6 , 12또는 면역 세포에 의한 식세포작용을 위한 오프소닌 작용 5 , 11 , 17 , 18 , 19 . 흥미롭게도, 세대를 거쳐 전해지는 면역 프라이밍이 Vg 10 를 통해 발생할 수 있다는 것이 발견되어 Vg 면역 기능과 생식 기능 간의 연관성을 시사합니다. Vg는 또한 막을 인식하고 20 , 21 다양한 메커니즘을 통해 산화 스트레스로부터 보호하는 것으로 나타났습니다 21 , 22 , 23 . 또한 곤충에서 Vg는 다양한 호르몬을 조절하고 기능적으로 상호 작용하는 것으로 밝혀졌습니다 24 , 25 . 꿀벌과 개미와 같은 사회성 곤충의 경우 Vg는 영양 및 대사 상태의 함수로서 불임 근로자의 사회적 역할을 제어하는 동시에 다양한 계급의 매우 다양한 수명을 제어합니다 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . 이는 산화적 손상으로부터 보호하는 능력을 통해 가장 가능성이 높습니다. 더 최근에는 Vg의 절단 산물이 핵으로 이동하여 유전자 발현을 조절할 수 있다는 제안이 있었는데, 30 이는 Vg가 다양한 기능 중 일부를 발휘할 수 있는 가능한 메커니즘을 암시합니다. 그러나 Vg 다형성과 관련된 기능적 데이터의 분자적 기초에 대한 이해는 제한적입니다. 구조적으로 Vg는 LLTP 슈퍼패밀리 1

에 공통적인 지질 결합 모듈을 특징으로 합니다 . 천년의 전환기에 은칠성장어 알(Ichthyomyzon unicuspis)에서 얻은 단백질 분해 처리된 Vg 산물인 리포비텔린(Lv)의 결정 구조는 LLTP 지질 결합 모듈을 엿볼 수 있게 해주었고, 특히 Vg 지질 결합 공동 31 , 32 과 발달 중인 배아의 영양원으로서의 생식적 역할에 대한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 이 구조는 Vg 시퀀스의 약 75%만을 덮고 있었고 전체 도메인이 누락되었고 여러 개의 유연한 스트레치가 있었습니다. 은칠성장어(IuLv)의 리포비텔린 외에도, 인간 MTP의 결정 구조 내에서 LLTP 지질 결합 모듈이 실험적으로 관찰되었는데, 이는 LLTP의 지질 결합 공동이 훨씬 작음을 보여주며, 이는 다른 LLTP의 운반체가 아닌 지질 로딩 단백질인 LLTP의 역할에 적응하는 것으로 보입니다 . 최근, 저온 전자현미경(cryo-EM)을 이용하여 천연 생 간 용해물로부터 인간 MTP를 재구성할 수 있었습니다 . 비텔로제닌은 분류군 특이적 루프와 도메인 추가에 의해 광범위한 구조적 변이를 보입니다 . 또한, 단백질 분해에 의한 절단 과정의 차이로 인해 각기 다른 사슬이 생성됩니다 . 35 , 36 IuLv 31 에서 관찰된 것처럼 단일 단위로 함께 작동할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다 .은칠성장어 리포비텔린에서 일부 도메인은 별도의 단백질 사슬로 형성된 지질 결합 모듈에서 누락되었습니다.이 분자적 복잡성은 스플라이싱 변형 9 의 존재 , 단일 종에서의 여러 비동일 유전자 사본 및 일부 종에서의 Vg 유사 단백질의 존재로 인해 더욱 증가합니다.다른 분류군에서 신기능화 및 하위 기능화를 통한 다형성은 Vg 진화 역사의 본질적인 특성인 것으로 보입니다 37. Vg 다형성에 대한 많은 연구는 꿀벌(Apis mellifera 및 Apis cerana)을 위해 수행되었습니다 .

이 널리 분포하는 종은 광범위한 생태적 및 경제적 영향과 함께 동물 건강을 위한 Vg의 중요성을 강조합니다. 본 연구에서는 꿀벌 Vg(AmVg)의 혈림프에서 분리한 3.2 Å 분해능 극저온 전자현미경(cryo-EM) 구조를 보고합니다. 이는 척추동물이 아닌 종에서 거의 전체 길이를 포함하는 최초의 구조입니다. 여기에는 다른 LLTP에도 존재하는 vWD(von Willebrand factor type D) 도메인이 포함됩니다. 1 LLTP 상과 단백질에 대해서는 기능이 알려지지 않았으며 이전에 보고된 적이 없습니다. 또한 C 말단 도메인에서 추정 이합체화 부위를 확인했으며, 이를 C 말단 시스틴 매듭(CTCK) 도메인으로 분류합니다. 또한, 본 연구에서 보고된 구조는 비텔로제닌의 번역 후 변형, 금속 및 지질과의 결합에 대한 통찰력을 제공합니다. 생물학적 유의성이 불분명한, 이전에는 특성이 규명되지 않았던 절단 산물의 구조도 3.0 Å에서 규명되었습니다. 이러한 모든 발견은 Vg 다형성, 특히 꿀벌의 다형성 기전을 이해하는 데 있어 큰 진전을 의미합니다. 영어: 여기에 설명된 비텔로제닌의 많은 구조적 요소와 도메인은 LLTP 슈퍼패밀리의 다른 멤버들과 공유합니다.

결과

토착 소스에서 얻은 비텔로제닌의 cryo-EM 구조

AmVg가 많은 기능을 발휘할 수 있게 하는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 꿀벌 의 혈림프에서 정제한 AmVg의 cryo-EM 구조를 3.2Å(그림 1, 보충 표 S1)로 결정 했습니다 . 샘플 은 이질적이었고 전체 길이의 단백질과 전체 길이의 단백질과 유사한 풍부도로 약 150kDa AmVg 절단 산물과 함께 전체 길이의 단백질을 포함했습니다.절단 산물의 입자는 3.0Å의 분해능 맵을 생성했습니다.두 입자 클래스 모두에서 AmVg는 단량체로 관찰되었고 이량체화의 증거는 없었습니다.AmVg와 다른 LLTP 구조의 일반적인 시퀀스 및 구조 비교가 그림 2 에 나와 있습니다 .
그림 1: 네이티브 AmVg의 크라이오-EM 구조.a Apis mellifera(AmVg)의 전장 Vg의 도메인 구조.다른 도메인과 하위 도메인은 다르게 채색되었으며, 실험 구조에서 관찰되지 않은 유연한 영역은 회색으로 음영 처리되었습니다.이황화물 결합도 표시됩니다(이황화물 결합 모델링에 대한 자세한 논의는 보충 그림 S3 에서 찾을 수 있습니다 ).b 도메인과 하위 도메인으로 채색 및 표시된 다른 방향의 3.2 Å 분해능에서 네이티브 AmVg의 크라이오-EM 밀도 맵.c 패널 (b) 및 (a)에서와 같이 도메인과 하위 도메인으로 채색된 AmVg 구조의 리본 모델.전체 크기 이미지 그림 2: LLTP 슈퍼패밀리 구성원의 도메인 조직 및 실험 구조.a 꿀벌(AmVg)의 전장 Vg의 도메인 구조 .크라이오-EM 구조에서 관찰되지 않은 유연한 영역을 밝은 회색으로 음영 처리하여 보여주는 두 번째 표현. 우리 샘플에서 관찰한 AmVg의 절단 생성물의 도메인 구조도 표시됩니다.아래에 은칠성장어(IuVg)의 Vg와 그 절단 생성물 Lv(IuLv)의 도메인 구조가 표시됩니다.유연성으로 인해 실험적으로 관찰되지 않은 영역은 IuLv의 결정 구조에 대해 밝은 회색으로 음영 처리되었습니다 32. 마지막으로, 결정 구조가 보고된 인간 MTP(HsMTP)의 도메인 구조도 표시됩니다 33.b 도메인과 하위 도메인으로 색상이 지정된 모든 실험적으로 해결된 LLTP의 원자 모델.전체 길이의 AmVg와 비교한 각 구조의 백본 제곱 평균 제곱근 편차(RMSD) 값이 표시됩니다. 전체 크기 이미지 다중 시퀀스 정렬 구조 데이터는 상동 시퀀스의 다중 시퀀스 정렬(MSA)로 보완되어 잔류물 위치의 보존에 대한 정보를 제공했습니다.이는 다양한 구조적 요소의 보존에 대한 통찰력과 크라이오-EM 밀도가 결정적이지 않을 때 이러한 요소의 존재에 대한 확신을 제공했습니다. 두 가지 다른 정렬이 수행되었는데, 하나는 절지동물의 상동체만을 포함하는 정렬이고, 다른 하나는 척추동물의 비텔로제닌을 포함하는 더 광범위한 정렬입니다(보충 그림 S2 ). 지질 결합 모듈 예상대로 AmVg는 LLTP 지질 결합 모듈을 포함하고 있으며, 이는 수용체 결합을 담당하는 N 시트 (38 , 39) 를 포함한 여러 하위 도메인으로 특징지어집니다.

, A 및 C-시트에 의해 형성된 지질 결합 공동 자체와 A 및 C-시트를 감싸는 α-나선 하위 도메인.N-시트는 N-말단에서 발견되며 중앙 α-나선 주위를 감싸는 반평행 β-시트에 의해 형성됩니다.시트는 배럴을 형성하기에는 가닥이 하나 부족하고 매우 다른 길이의 가닥을 가지고 있어 지질 결합 공동에서 N-시트와 A-시트 사이에 겹쳐서 β-샌드위치를 형성할 수 있습니다.이미 IuLv 31에서 관찰되었습니다.N- 시트 에는 길이가 다른 루프가 포함되어 있으며 그 중 일부에는 짧은 나선이 포함되어 있습니다.루프 중 하나에서 IuLv 및 인간 MTP(HsMTP)에 보존된 이황화물 브리지(C178–C222)가 A-시트와 통합되는 짧은 β-가닥을 안정화하는 것으로 보입니다. 흥미롭게도, 이 짧은 β-가닥 이후, 나머지 루프(잔기 232-245)에서는 밀도가 관찰되지 않는데, 이는 아마도 유연성 때문일 것이다. 동등한 루프는 꿀벌 Vg에 대해 보존되지 않는 두 번째 이황화물을 포함하는 IuLv에 대해 잘 분해능이 있다. 이 루프는 나중에 논의할 것처럼 AmVg에서 아연 결합에 의해 안정화될 수 있다. 잔기 147-160의 길고 용매에 노출된 부분은 짧은 나선을 형성하는 AmVg 절단 산물에 대해서만 잘 분해능이 있다.

N-시트와 α-나선 도메인 사이의 잔기 340-384로 구성된 영역은 곤충 비텔로제닌의 특징인 폴리세린 영역(polyS)에 해당한다 35. 이 영역은 핵자기공명(NMR) 분광법을 사용하기 전에 연구되었으며, 매우 무질서한 것으로 나타났으며, 프로테아제 결합 부위와 여러 개의 인산화된 세린 잔기가 절단을 방해한다 40 . 당연히 AmVg에서는 이 영역의 극저온 전자현미경(cryo-EM) 밀도가 관찰되지 않습니다. 그러나 높은 윤곽선 수준에서는 루프가 발견되는 계면에서 단백질 옆에서 명확하게 정의되지 않은 밀도가 관찰됩니다. 단백질의 정렬된 영역에서 염기성 측쇄는 명확하게 정의되지 않은 극저온 전자현미경 밀도(H2O, K264, H265, K112, H113, K601 및 H602)를 가리키며, 이는 유연한 폴리세린 영역의 인산화된 잔기와 잠재적인 이온 상호작용을 보여줍니다.

α-나선형 하위 도메인은 두 층으로 배열된 17개의 긴 α-나선으로 구성되어 초나선형 오른손 코일을 형성합니다. 나선은 각 층 내에서는 평행하고 층 사이에서는 반평행합니다. 층 사이의 계면은 소수성인 반면, 용매에 노출된 표면은 최대 34개의 양전하 아미노산을 포함하는 매우 높은 양전하를 띱니다(그림 3e ). 하위 도메인의 높은 하전 표면은 막 결합과 관련이 있습니다 .일부 양전하 아미노산은 염다리(E435–K450, R498–E526, K514–E551, R547–E609, E617–R629, R664–E695 및 R700–D727)를 통해 하위 도메인을 안정화하는 데 기여합니다. 여기서 나선 사이의 일부 루프는 IuLv보다 상당히 깁니다. 여기에는 도메인 시작 전 두 개의 짧은 나선(잔기 387–421)을 포함하는 구간, 긴 나선 3번과 4번 사이의 루프(잔기 473–488), 그리고 나선 9번과 10번 사이에서 발견되는 아연 결합에 관여하는 것으로 추정되는 두 개의 짧은 나선(잔기 581–604)을 포함하는 곤충 특이적 루프 21 이 포함됩니다.
그림 3: AmVg 구조의 세부 사항. a, b 7σ에서 윤곽이 그려진 지질 결합 공동의 내부와 가장자리의 모델링되지 않은 부분 지질 밀도.c 7σ에서 윤곽이 그려진 지질 결합 공동의 가장자리에서 확인된 인지질 머리 그룹.d N296에서의 당화.밀도의 품질은 처음 두 개의 N-아세틸글루코사민 단위의 N-아세틸기를 식별하고 낮은 윤곽 수준에서 최대 3개 이상의 만노스 단위를 식별할 수 있게 해줍니다.1σ에서 윤곽이 그려진 AmVg의 고해상도 절단 생성물에 대한 밀도를 보여줍니다.e 파란색으로 표시된 염기성 아미노산의 측쇄가 있는 α-나선형 도메인의 용매를 향한 관점은 Vg가 막을 결합하는 능력과 관련이 있습니다 21 . 전체 크기 이미지 C-시트의 구조는 IuLv C-시트의 구조와 유사합니다.잔기 842-873에 해당하는 나선을 포함하는 루프는 vWD 도메인을 감싸서 도메인 간 안정화에 관여합니다. 이 루프는 vWD 도메인이 없는 경우 유연하며, 이는 IuLv와 AmVg 절단 산물에서 관찰된 경우와 같습니다. A-시트는 오목한 모양이며 C-시트보다 상당히 큽니다. A-시트는 지질 결합 공동의 대부분을 정의합니다. 흥미롭게도, 지질 결합 공동의 앞쪽(그림 1 참조 )에 가장 가까운 A-시트 영역은 AmVg에서 IuLv와 다른 구조를 보입니다. IuLv에서는 기능이 알려지지 않은 반무질서하고 고극성인 글루타민이 풍부한 미니 도메인 31 이 이 영역에 존재하여 지질 결합 공동에 상당히 다른 개구부를 형성합니다. 지질 결합 공동의 꼭대기에는 척추동물 비텔로제닌이 포스비틴 사슬에 해당하는 루프를 가지고 있습니다. 곤충 비텔로제닌의 폴리세린 영역과 유사하지만 기능적으로 동일하지는 않은 이 세린이 풍부한 영역은 단백질 분해 절단에 의해 방출되며 IuLv 31 과 관련된 형태는 관찰되지 않습니다.

IuLv 구조에서 포스비틴이 관찰되는 루프에서, AmVg는 A-시트(잔기 1144~1189) 위에 위치하는 양쪽 말단에 구조화되지 않은 뻗은 부분이 있는 긴 나선 구조를 가지고 있습니다. IuLv와 비교했을 때, vWD 도메인 쪽으로 뻗어 있는 루프는 더 깁니다. 잔기 1291~1336으로 구성된 루프는 이황화 결합(C1310~C1324)으로 안정화된 위치를 가진 세 개의 α-나선 구조를 가지고 있습니다. 이러한 루프는 약간 더 긴 β-가닥과 함께 지질 공동의 용매 노출을 효과적으로 줄이고 vWD 도메인과 A-시트 사이의 상호작용 표면을 증가시킵니다. A-시트는 지질 결합 공동의 가장자리를 형성하는 긴 α-나선으로 덮여 있으며, 칠성장어 Lv에서 보존됩니다. A-시트와 C-시트는 지질 결합 공동의 뒷면을 형성하는 시트에 수직으로 달리는 α-나선에 의해 연결됩니다(그림 1a 의 더 어두운 주황색 ).vWD
및 CTCK 도메인

지질 결합 모듈의 C-말단에서 vWD 도메인을 관찰합니다(그림 4d ).이것은 맵에서 밀도가 나타나지 않는 유연한 영역을 통해 지질 결합 모듈에 연결됩니다(잔기 1411–1432).vWD 도메인은 A-시트와 C-시트 사이의 지질 공동 개구부의 위쪽 뒤쪽에 있습니다.C-시트와의 상호 작용에 관여하는 긴 루프(잔기 1573–1492)와 3개의 짧은 나선을 포함하는 C-말단의 길고 대부분 구조화되지 않은 영역이 있는 베타 샌드위치가 특징입니다. vWD 도메인은 주로 인간에서 연구된 기능적으로 관련 없는 동족체에서 보존된 다양한 이황화물 결합에 의해 안정화됩니다.여기에는 점액소와 vWF(C1444–C1598, C1466–C1634, C1615–C1650)가 포함됩니다 41 , 42 (보충 그림 S3 ).점액소와 vWF에서 vWD 도메인은 분자 간 이황화물 결합을 통해 안정화되는 동종이량체화를 담당하는 동반 모듈 C8-3 및 트립신 억제제 유사(TIL)와 함께 발견됩니다(그림 4a ).중요한 점은 모든 비텔로제닌에서 vWD 도메인과 함께 C8-3 및 TIL3 모듈이 없다는 것입니다(그림 4d ).게다가 모든 시스테인은 분자 내 이황화물 결합에 관여합니다.따라서 추가적인 분자 간 이황화물 결합을 형성하는 데 사용할 수 있는 시스테인이 없습니다.
그림 4: Vg 및 기능적으로 관련 없는 동족체의 von Willebrand D형(vWD) 및 C말단 시스틴 매듭(CTCK) 도메인. a vWD(수반되는 모듈 C8-3, TIL3 및 E3 포함) 및 인간 von Willebrand 인자(HsvWF)의 CTCK 도메인의 구조 42

. 분자 내 이황화물 결합은 노란색 막대로 표시되고 분자 간 이황화물 결합에 관여하는 시스테인은 어두운 구체로 표시되어 있습니다. b 이러한 도메인이 분자 간 이황화물 결합을 통해 긴 연쇄체(concatemer)를 형성하는 방식을 개략적으로 나타낸 것입니다. vWF에서 이러한 연쇄체는 생물학적 기능과 관련된 특정 기계적 특성을 나타냅니다. 점액에서 동등한 상호작용이 관찰되었습니다 59 , 82 . c 인간 호르몬 융모성 성선자극호르몬(HsCG)의 CTCK 도메인 60 . 이 CTCK 도메인은 분자 간 이황화물 결합을 안정화하지 않고도 안정적인 이량체를 형성할 수 있습니다. 분자 내 이황화물 결합은 노란색 막대로 표시되고 이량체화에 관여하는 영역은 노란색 뻗은 부분으로 표시되어 있습니다. d vWD 도메인의 실험적 구조와 AmVg에서 CTCK 도메인의 AlphaFold 2 예측. vWF나 뮤신처럼 분자 간 이황화물 결합 형성에 필요한 시스테인은 없습니다. Vg는 융모성 성선자극호르몬(HsCG) CTCK 도메인처럼 CTCK 도메인 간의 비공유 결합을 통해 이량체화를 달성할 수 있습니다(패널 c). 제시된 관련 구조의 PDB ID는 연한 보라색 상자 안에 표시되어 있습니다.
전체 크기 이미지

마지막 이황화물 결합(잔기 C1615–C1650) 이후에 AmVg에 대한 밀도는 관찰되지 않습니다(단백질이 긴(35개 잔기) 유연한 링커를 통해 vWD 도메인에 연결된 알려지지 않은 기능의 작은 C 말단 도메인을 가질 것으로 예측되는 곳(보충 그림 S4 ). C 말단 도메인은 지질 결합 공동을 게이팅하는 데 참여하는 것으로 제안되었습니다 43. Foldseek를 사용하여 C 말단 도메인에 대한 AmVg의 AlphaFold 2 예측을 기반으로 한 구조적 정렬 44 은 그것이 C 말단 시스틴 매듭 도메인(CTCK)임을 보여줍니다(그림 4d ). CTCK 도메인은 종종 점액 및 vWF와 같은 vWD 도메인을 포함하는 단백질에서 발견됩니다(그림 4a ). CTCK 도메인은 분자 간 이황화물 결합을 통해 동종이량체화를 안정화합니다. vWF 및 CTCK 도메인을 통한 동종이량체화의 조합은 점액과 긴 연결체를 형성합니다. vWF(그림 4b ) 41 , 45.
당화 .

다양한 비텔로제닌 간의 당화 보존도는 일반적으로 낮습니다. 서열 분석 결과 꿀벌 Vg에 대해 예측된 세 가지 N-당화 중 46 , 단 하나의 당화만 확인되었습니다. 바로 N-시트의 N296에 공유 결합된 탄수화물입니다(그림 3d ). Vg N-연결 글리칸은 척추동물과 무척추동물 모두에서 유래한 고만노스 올리고당의 기본 단위를 포함하며, 말단에 다양한 양의 포도당 잔기를 가지고 있습니다 47 , 48 , 49글리칸 트리의 정확한 정체는 알려져 있지 않지만, 트리 바닥에 모델링된 잔류물의 정체는 cryo-EM 밀도를 기반으로 Osir et al.의 NMR 연구 결과와 일치하여 명확합니다 .48 . 우리의 구조에는 처음 두 개의 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc)과 세 개의 만노스 잔류물이 포함됩니다. 나머지 잔류물은 cryo-EM 맵 밀도 없이도 유연합니다. 글리코실화 트리의 바닥은 N-시트의 긴 구조적 루프에 의해 안정화됩니다. 이 루프는 척추동물 IuLv 구조에는 존재하지 않으며, N-시트 표면에서 N-글리코실화될 수 있는 동등한 아스파라긴 잔류물을 찾을 수 없습니다. 실제로 N296은 엄격한 MSA에서 부분적으로만 보존되어 이 특정 글리코실화가 일부 절지동물에만 존재한다는 것을 보여줍니다.
지질 결합

비텔로제닌은 질량의 약 16%를 지질로 함유합니다 32 , 49 . 여기에는 대부분 인지질이 포함되지만 인지질만은 아닙니다. 결합은 일반적으로 비특이적이며 지질 결합 잔류물은 매우 낮은 보존성을 보입니다(보충 그림 S2 ) 32 , 33. AmVg에서는 단 하나의 인지질의 헤드그룹만 모델화할 수 있는 반면, 지질 사슬의 일부에 속할 가능성이 있는 작은 밀도의 덩어리가 지질 결합 공동의 다른 부분에서 관찰됩니다(그림 3a –c). 모델화되지 않은 밀도 덩어리(그림 3a , b)는 작고 비극성이며 보존되지 않은 하위 공동에서 발견되므로 확인되지 않은 번역 후 변형이나 특정 리간드 결합 부위에 속할 가능성은 낮습니다. AmVg에서 지질 극저온 전자현미경 밀도가 일반적으로 부족한 것은 기본 조건에서 지질 상호 작용의 일반적으로 무질서하고 역동적인 특성을 보여줍니다. AmVg(33,506 Å3)와 IuLv(33,179 Å3)의 지질 결합 공동은 부피가 유사하지만, IuLv 공동의 전형적인 깔때기 모양은 AmVg에서는 보존되지 않고, 깔때기의 좁은 부분이 용매 접근으로부터 완전히 차단됩니다. AmVg의 절단 산물에 대한 공동의 모양은 절단되지 않은 단백질의 공동과 유사하지만, 부피(16,168 Å3)는 자신을 감싸고 있는 더 짧은 A-시트로 인해 상당히 작습니다. 지질 결합 공동의 극성 또한 AmVg와 IuLv에서 유사합니다. 공동 바닥의 양전하를 띤 잔기는 인지질 헤드기와 상호작용하는 것으로 여겨지는 반면, 공동의 덜 극성인 측면과 상단은 비극성 지질을 수용할 수 있는데, 이는 IuLv 32 에서 처음 기술된 바와 같습니다.. AmVg, 그 절단 산물 및 IuLv의 지질 결합 공동 사이의 가장 명확한 차이점은 접근성과 용매 노출이며, 이는 AmVg의 절단 산물에 대한 섹션에서 나중에 설명할 것입니다. Cryo-EM 데이터 처리 방법(방법 섹션에 설명됨)을 사용하여 AmVg의 역학을 분석한 결과 지질 결합 공동의 큰 열림 또는 닫힘 동작이 나타나지 않았습니다.

IuLv에서 지질은 주요 지질 공동뿐만 아니라 N-시트 하위 도메인의 작은 공동에도 결합합니다. AmVg의 경우, 동등한 영역에 추가 단백질 밀도가 포함되어 있으므로 그러한 공동이 관찰되지 않습니다. 이러한 밀도는 폴리세린 영역과 α-나선 도메인 사이의 더 긴 연결자에 해당합니다.
추정 금속 이온 결합 부위

Vg는 발달 중인 난모세포에 아연 이온을 제공하는 것으로 알려져 있으며, 금속 이온은 항산화 활성에 역할을 하는 것으로 제안되었습니다 21 . Vg가 운반하는 아연 이온의 수는 종마다 다르며 50 , 51 , 52 , 히스티딘 잔류물은 아연 결합에서 중심 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다 53. 꿀벌의 경우 최근 Vg 분자 하나에 평균 3.5개의 아연 이온이 결합한다는 것이 밝혀졌습니다 54. 중요한 점은 꿀벌 혈림프에서 AmVg를 정제하는 동안 금속 킬레이터를 사용하지 않았고 정제하는 동안 완충액에 2가 양이온을 포함하지 않았다는 것입니다. 우리는 구조에서 세 개의 추정 결합 부위를 확인했지만(그림 5 ), 이러한 위치 대부분에서 금속 이온의 밀도는 명확하지 않습니다. 세 부위 모두에서 아연을 모델링하여 결합 거리와 기하학을 분석했지만(보충 그림 S5 ), 재구성의 제한된 해상도와 불완전한 배위 구가 낮은 점유율을 나타낼 가능성이 있어 결론을 내리기 어렵습니다. AmVg에 대한 금속 결합에 대한 추가 정보는 AlphaFold 55 의 최신 릴리스 (보충 그림 S6 ) 및 MSA에서 분석된 시퀀스에서 히스티딘 쌍의 발생을 포함한 보존 데이터(보충 그림 S2 )에서도 얻을 수 있습니다.
그림 5: AmVg의 추정 Zn2+ 결합 부위.